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1. 取出細(xì)胞爬片，迅速置入冷丙酮固定 20~30 分鐘。

2. 蒸餾水浸泡 5 分鐘，2 次。

3. 打孔液浸泡 5 分鐘。

4. 蒸餾水浸泡 5 分鐘，2 次。

注：第 3、4 步僅用于檢測細(xì)胞內(nèi)抗原，檢測細(xì)胞膜抗原時不用。

5. 正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 （保持組織呈濕潤狀態(tài),）滴加正常山羊或兔血清 （與第二抗 體 同源動物血清）處理，37℃，15 分鐘。

附：正常血清配制 （ 或按試劑盒規(guī)定的濃度配制）：按 1:20比例，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl （10%拋灑量） 計算。

6. 滴加*抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加*抗體，37℃ 2 小時（也可置于 4℃冰箱過夜） 。

7. PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

8. 滴加生物素化的二抗，37℃，40 分鐘。

9. PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

10. 滴加三抗 （SAB 復(fù)合物） ，37℃，40 分鐘。

11. PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

12. DAB 顯色，鏡下觀察，適時終止（自來水沖終止） 。

附：DAB 的配制① 儲備液（DAB 25mg/ml）的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待*溶解后分裝成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，凍存。② 工作液：DAB 儲備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

13. 自來水（細(xì)水）充分沖洗。

14. 蘇木素復(fù)染，室溫，30 秒，自來水沖洗。

15. 自來水沖洗返藍(lán)，15 分鐘。

16. 梯度酒精脫水：80%，2 分鐘 95%，2 分鐘 100%，2 次，5 分鐘。

17. 二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分鐘

18. 封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。